bełchatów 1 maja

Wydzielono wysepki trzustkowe od samców szczurów Wistar (200 g, Harlan Winkelmann GmbH) i hodowano jak opisano wcześniej (35). W celu pomiaru glukagonu i uwalniania insuliny wysepki głodzono w zbilansowanym roztworze soli Earle a zawierającym mM glukozy przez 30 minut. Grupy 10 (glukagonu) lub 3 (insuliny) wysepek wybrano i przeniesiono do 0,3 ml pożywki EBSS z badanymi związkami. Wysepki dalej inkubowano przez 90 minut w 37 ° C z nośnikiem lub FGF-21 (1 (Ig / ml), supernatanty zebrano i zmierzono zawartość hormonów. Protokoły in vivo. Protokoły zastosowane w tych badaniach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Kontroli i Użytkowania Zwierząt w Laboratorium Eli Lilly Research Laboratories. Myszy utrzymywano w kontrolowanym środowisku (21 . 2 ° C, 50 . 60% wilgotności, 12-godzinny cykl światło-ciemność, światła włączano o 6 rano). Samce myszy ob / ob i db / db pochodziły od Harlana Teklad, karmionego Purina 5008 Chow i miały swobodny dostęp do pożywienia i wody. FGF-21 podawano przez wstrzyknięcie sc w soli fizjologicznej. W przypadku OGTT zwierzęta poszczono 16 godzin i poddano prowokacji doustnym obciążeniem glukozą (2,5 g / kg) godzinę po ostatnim wstrzyknięciu. Próbki krwi pobierano od świadomych, karmionych zwierząt za pomocą ogona ogonowego, a poziomy glukozy i triglicerydów w osoczu oznaczano stosując, odpowiednio, Precision G Blood Glucose Testing System (Abbott Laboratories) i Hitachi 912 Clinical Chemistry (Roche Diagnostics Corp.). Poziomy insuliny i leptyny oznaczono za pomocą mysich zestawów ELISA (Crystal Chem Inc.). Samce otyłych szczurów ZDF szczupłych lub szczupłych uzyskano od Charles River Laboratories Inc. i trzymano pojedynczo w środowisku o kontrolowanej wilgotności i temperaturze (21 . 2 ° C, wilgotność 50 . 60%, 12-godzinny cykl światło-ciemność, światła w 6 ° C). am) z bezpłatnym dostępem do żywności (Purina 5008 Chow) i wody przez 2 tygodnie przed rozpoczęciem eksperymentu. W dniu poprzedzającym badanie wszystkie zwierzęta poddano pobieraniu krwi, a glukozę w osoczu analizowano w analizatorze chemicznym Hitachi 912 Clinical Chemistry (Roche Diagnostics Corp.). Szczury następnie randomizowano na podstawie ich poziomów glukozy i masy ciała i umieszczano w grupach. Zwierzętom podawano nośnik (0,9% roztwór soli), insulinę (Humulin, Eli Lilly and Company) lub FGF-21 przez 7 kolejnych dni podawania dwa razy dziennie. W dniach 3 i 7 karmione szczury krwawiano (za pomocą ogona ogonowego) w godzinę po podaniu ostatniej dawki, a glukozę w osoczu oznaczano jak opisano powyżej. Ludzki promotor apoE, w tym jego wątrobowy region kontrolny (42) zastosowano do ekspresji cDNA ludzkiego FGF-21 u myszy transgenicznych. Transgeniczny wektor linearyzowano i mikroiniekowano jaja C57BL / 6NTac standardowymi metodami (43). Zidentyfikowaliśmy myszy transgeniczne za pomocą PCR, stosując startery specyficzne dla transgenu i potwierdzoną ekspresję transgenu przez ilościową PCR w czasie rzeczywistym na RNA wyizolowanym z wątroby, jak również w teście ELISA na osoczu otrzymanym od myszy transgenicznych przy użyciu przeciwciała poliklonalnego FGF-21. W celu karmienia wysokotłuszczowego wszystkie myszy trzymano pojedynczo w klatkach Micro-Isolator (Lab Products Inc.) i utrzymywano od wieku 24 dni na wysokotłuszczowej karmie TD 95217 (40% tłuszczu; Harlan Teklad) z wolnym dostępem do pożywienia i wody. Do ilościowego oznaczenia masy tkanki stosowano instrument magnetycznego rezonansu jądrowego szerokopasmowego (NMR) (Bruker BioSpin Corp.). Nieuczulone myszy umieszczono w szklanym cylindrze o średnicy 5 cm, który został opuszczony do przyrządu. Dane uzyskano przez 4,5 minuty (3 oznaczenia w odstępach 1,5-minutowych) i analizowano za pomocą oprogramowania producenta. Średnią trzykrotnych oznaczeń pozornej masy mięśniowej, masy tłuszczu i wolnej masy wody obliczono dla każdej myszy. Współczynnik zmienności wszystkich 3 mas określony dla ruchomej myszy na żywo wynosił mniej niż 3%. Podziękowania Pragniemy podziękować P. Atkinson, G. Kelly, T Czarny, B. Pies i B. Strajk do podtrzymywania produkcji białka FGF-21; D. Bruce Baldwin do generowania konstruktów fuzyjnych FGFR-FC; S. Bright i J. Dunbar dla eksperymentów wiązania FGF-21 / FGFR; S. Sissons i W. Roell za pomoc w wychwycie glukozy i testach proliferacji; N. Fox i K. Brune dla generacji transgenicznych zwierząt FGF-21a; K. Coble za pomoc w badaniach farmakokinetycznych; M. Brenner i A. Efanov o pomoc w eksperymentach z wydzielaniem glukagonu; D. Ballard i K. Mintze za wspieranie pracy histochemicznej; C. Shrake do pomocy in vivo; J. Manetta i L. Slieker do generowania poliklonalnych przeciwciał anty-FGF-21, anty-GLUT1 i anty-GLUT4; A. Klip (szpital dla chorych dzieci, Toronto, Ontario, Kanada) na komórki L6-GLUT-4myc; J. Caro, S. Jacobs i G. Etgen za krytyczne przeczytanie rękopisu; oraz T. Bumol, B. Grinnell, A. Glasebrook, R. Smith i S. Taylor za pomocne dyskusje. Przypisy Niestandardowe skróty: BAT, brązowa tkanka tłuszczowa; BMP-9, morfogeniczne białko kości. 9; EC50, 50% skuteczne stężenie; FGFR, receptor FGF; FRS-2, substrat FGFR2; GLP-1, peptyd glukagonopodobny a1; GLUT, transporter glukozy; HFHC, dieta wysokotłuszczowa / bogata w węglowodany; HMEC, pierwotna ludzka komórka nabłonka sutka; HUVEC, komórka śródbłonka żyły pępkowej człowieka; OGTT, doustny test tolerancji glukozy; PCNA, jądrowy antygen komórki proliferacyjnej; ZDF, Zucker diabetic tłuszczowy. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[patrz też: ciśnienie krwi normy, budowa stawu kolanowego, choroba behceta ]