borowik ponury boletus luridus

Szczep M3 (3375) został dostarczony przez Jamesa Mussera (Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA). Szczep M28 (S2356) pochodził z naszej kolekcji laboratoryjnej. Odczynniki. Wytwarzanie surowice odpornościowe królika przeciwko syntetycznemu peptydowi SM18 (1-30) C opisano wcześniej (8). Antysurowice były również wytwarzane przeciwko rekombinowanemu M18, który oczyszczono z periplazmatycznych ekstraktów Escherichia coli, jak opisano wcześniej (8, 10). Królicze surowice odpornościowe podobnie przygotowano na oczyszczonym Spa (8). Peptyd kopiujący NH2-końcowe 23 reszty aminokwasowe Spa [S-Spa18 (1-23) C] został komercyjnie zsyntetyzowany (Research Genetics Inc., Huntsville, Alabama, USA) i chemicznie sprzężony z KLH metodami opisanymi poprzednio (11). ). Antysurowice przeciwko S-Spa18 (1-23) C-KLH hodowano w królikach zgodnie z naszym standardowym, opublikowanym protokołem (11). Wprowadzanie p-interposonu do emm18 i transformacja paciorkowców typu 18. Inaktywację inaktywacji emm18 przeprowadzono zasadniczo jak opisano wcześniej dla paciorkowców typu 24 (6). Pokrótce, emm18 poddano ligacji do pKK223-3, a następnie cięto XhoI, który rozpoznaje pojedyncze miejsce pomiędzy zasadami 136 i 141 genu emm18. Końce zostały naprawione fragmentem Klenowa (12). pBR322-y Km2 strawiono Smal i fragment a Km2 oczyszczono z 0,8% żelu agarozowego i poddano ligacji z obciętym genem emm18 (12). Otrzymany plazmid, pKKM18a, poddano elektroporacji do paciorkowców typu 18, jak opisano (6). Do dalszych badań wybrano jedną kolonię oporną na kanamycynę, oznaczoną M18 .. Southern blots. DNA chromosomu chromosomu streptokokowego strawiono BsaHI i poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym. Fragmenty DNA przeniesiono na membranę nylonową (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) i sondowano znakowanym digoksygeniną fragmentem. Km2 lub emm18 zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA). USA). Western blot. Western bloty przeprowadzono przy użyciu ekstraktów z nietkniętych paciorkowców i oczyszczonych białek, jak opisano wcześniej (13). W niektórych doświadczeniach z użyciem oczyszczonego rekombinowanego białka Enn18, membrany nitrocelulozowe najpierw inkubowano w buforze zawierającym 10% normalnej ludzkiej surowicy, aby zablokować niespecyficzne wiązanie immunoglobulin. Klonowanie i sekwencjonowanie enn18. Szczep 18 typu (87-282) stosowany w tych badaniach zawiera gen podobny do M, enn18, poniżej genu emm18 (4). Chociaż wykazano, że Enn18 ulega ekspresji jedynie w niskich poziomach przez ten szczep paciorkowców grupy A (14), sklonowaliśmy gen enn18 i oczyszczono rekombinowane białko z ekstraktów E. coli. Oczyszczone Enn18 zastosowano w kolejnych doświadczeniach w celu określenia, czy przeciwciała Spa reagują krzyżowo z tym dodatkowym białkiem powierzchniowym. Gen enn18 został początkowo sklonowany za pomocą PCR z użyciem startera, który skopiował 3. koniec genu emm18 i primer odwrotny, który był specyficzny dla podrodziny SF3 genów podobnych do emmu (4). Oczyszczony produkt PCR ligowano do pKK223-3, a wstawkę sekwencjonowano standardowymi metodami (12). Nieuszkodzony gen enn18 został później sklonowany przy użyciu startera odwrotnego, który skopiował 5. koniec genu scpA (15), a oczyszczony produkt PCR poddano ligacji z pQE-30 (QIAGEN Inc., Chatsworth, California, USA). Rekombinowane białko Enn18 oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie z niklem zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez QIAGEN Inc. Opsonizacja i testy bakteriobójcze. Testy opsonizacji in vitro i testy bakteriobójcze przeprowadzono przy użyciu nieimmunologicznej pełnej krwi ludzkiej, jak opisano wcześniej (16). Pokrótce, mieszanki obrotowe zawierały 0,1 ml badanej surowicy odpornościowej, standardowe inokulum paciorkowców i 0,4 ml heparynizowanej (10 U / ml) krwi ludzkiej
[więcej w: chłoniak rokowania, choroba wieńcowa objawy, candida albicans objawy ]