danuta świeży okulista rybnik

Obserwacja obniżenia poziomu glukagonu u myszy ob / ob, którym wstrzyknięto FGF-21a (Tabela 2) dalej wzmacnia hipotezę, że ten hormon jest ważnym mediatorem efektów in vivo FGF-21. Zgromadzono dowody potwierdzające patofizjologiczną rolę glukagonu w rozwoju i progresji cukrzycy typu 2. Podstawowy glukagon jest nieprawidłowo podwyższony, a jego hamowanie po spożyciu pokarmu jest zaburzone, co prowadzi do zwiększonego wytwarzania glukozy w wątrobie i nasilenia hiperglikemii związanej z chorobą (33, 34). Co ciekawe, osłabienie sygnalizacji przez receptor glukagonu prowadzi do normalizacji poziomów glukozy i triglicerydów w osoczu u zwierząt z cukrzycą (35). Pomimo znacznego postępu w zrozumieniu patofizjologii cukrzycy i rozwoju nowych leków w leczeniu pacjentów z cukrzycą, ta choroba pozostaje poważnym problemem zdrowotnym (36). Potrzebne są nowe metody leczenia, które umożliwią skuteczną regulację glikemii i zmniejszą ryzyko działań niepożądanych związanych z obecnymi terapiami (27, 37, 38). Tutaj pokazujemy, że FGF-21, jako pojedynczy czynnik, może być stosowany do zapewnienia skutecznej i trwałej kontroli glukozy i obniżania triglicerydów u zwierząt z cukrzycą, bez widocznej mitogenności, hipoglikemii lub przyrostu masy ciała. FGF-21 jest zatem obiecującym, jako skuteczny środek terapeutyczny do leczenia cukrzycy. Metody Ekspresja i oczyszczanie FGF-21. Wektor pET30a zastosowano do ekspresji ludzkiego FGF-21 w szczepie Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen; EMD Biosciences Inc.). Produkt FGF-21 nagromadzony we frakcji nierozpuszczalnej. Ciała inkluzyjne przygotowano standardową metodą wirowania. Rozpuściliśmy ciałka inkluzyjne, wprowadzając granule granulek do 10-krotności pierwotnej objętości w 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 7 M mocznika i homogenizując materiał. Mieszaninę białka doprowadzono do pH 11, mieszano przez godzinę, ponownie dostosowano do pH 9,0 i wprowadzono na Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences). Chromatografię anionowymienną (AEX) przeprowadzono w 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 7 M mocznika, mM DTT i elucją gradientem 0. 400 mM NaCl. Eluowaną pulę AEX traktowano 10 mM DTT przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i rozcieńczono 10-krotnie 10 mM cysteiny / 7 M mocznika. Białko ponownie fałdowano przez dializę wobec 20 mM glicyny, pH 9,0, przez 48 godzin, w temperaturze 4 ° C. Dalsze oczyszczanie przeprowadzono z wysokosprawną chromatografią cieczową w odwróconych fazach (RP-HPLC) przeprowadzoną na kolumnie Grace Vydac C18 przebiegającej w fazie ruchomej H2O / 0,1% kwasu trifluorooctowego / acetonitrylu z gradientem 0 ~ 50% acetonitrylu; chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząstek w Superdex 75 (Amersham Biosciences) w PBS, pH 7,4; i chromatografia AEX na MonoQ (Amersham Biosciences) w 50 mM Tris, pH 8,0, z gradientem 0. 300 mM NaCl. Końcową pulę FGF-21 dializowano do PBS, pH 7,4, wyjałowiono przez filtrację i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Hodowla komórek, różnicowanie adipocytów, pobieranie glukozy i eksperymenty mitogenne. Komórki 3T3-L1, NIH 3T3, BALB / c 3T3, 4MBr5 i klon 9 pochodziły z American Type Culture Collection; HMEC i HUVEC z Clonetics Corp .; oraz pierwotne preadipocyty z Zen-Bio Inc. [0084] Opisany wcześniej protokół różnicowania adipocytów 3T3-L1 (39) został zaadaptowany do płytek 96-studzienkowych Cytostar T (Amersham Biosciences). Fibroblasty 3T3-L1 wysiano przy 25 000 komórek / zagłębienie; różnicowanie indukowano 2 dni później w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 0,25 .M deksametazonu, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyną i 5 .g / ml insuliny (48 godzin); i pożywkę zmieniono na DMEM / 10% FBS / 5 ug / ml insuliny (48 godzin). Następnie komórki inkubowano przez dodatkowe 9-20 dni w DMEM / 10% FBS (zmieniane co drugi dzień). Pierwotne ludzkie adipocyty wysiano w 96-studzienkowych płytkach z Cytostar T przy gęstości 15 000 komórek / studzienkę; zróżnicowany w pożywce Adipocyte (AM, Zen-Bio Inc.) z 0,05 mM IBMX, 0,1 .M deksametazonu, 10 nM insuliny i .M rozyglitazonu (14 dni); a następnie przechowywane w AM (zmieniane co drugi dzień) [przypisy: choroba somatyczna, chora tarczyca objawy, candida albicans objawy ]