klinika niepłodności kraków opinie

W celu wychwytu glukozy adypocyty głodzono przez 3 godziny w DMEM / 0,1% BSA, stymulowano FGF-21 przez 24 godziny i przemywano dwukrotnie buforem KRP (15 mM HEPES, pH 7,4, 118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,3 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 0,1% BSA) i 100 ul buforu KRP zawierającego 2-deoksy-D- [14C] glukozę (2-DOG) (0,1 Ci, 100 (M)) dodano do każda studzienka. Kontrolne studzienki zawierały 100 ul buforu KRP z 2-DOG (0,1 Ci, 10 mM) w celu monitorowania niespecyficzności. Reakcja wychwytu była prowadzona przez godzinę w 37 ° C, zakończona przez dodanie cytochalazyny B (20. M) i zmierzona przy użyciu licznika Wallac 1450 MicroBeta (Perkin Elmer). W doświadczeniach mitogenności komórki hodowano do konfluencji, głodzono przez 24 godziny w DMEM / 0,5% FCS, stymulowano przez 18 godzin i inkubowano z 0,25 Ci [3H] tymidyną na studzienkę przez 2 godziny. Lizaty komórkowe następnie zebrano i zliczono. Ekstrakcja RNA, synteza cDNA, ilościowa reakcja PCR. Użyliśmy zestawu RNeasy 96 (QIAGEN Inc.) do ekstrakcji RNA z komórek i odczynnika TRIzol (Invitrogen Corp.) w celu ekstrakcji RNA z tkanek. Przeprowadziliśmy odwrotną transkrypcję przy użyciu zestawu SuperScript First-Strand Synthesis (Invitrogen Corp.). Sekwencja startera do przodu i do tyłu dla GLUT1 wynosiła 5 (3-GCCCCCAGAAGGTTATTGA-3. i odpowiednio 5. -CGTGGTGAGTGTGGTGGATG-3 .. Sekwencją sondy była 5a-TCTCTACAATCAAACATGGAACCACCGCA-3 .. Aby znormalizować różnice w ilości całkowitego RNA dodanego do każdej reakcji, przeprowadziliśmy amplifikację 18S rybosomalnego RNA jako kontrolę endogenną. Immunoblot, immunoprecypitacja i testy multipleksowe. Adipocyty 3T3-L1 głodzono przez 18 godzin, stymulowano FGF-21 (1 .g / ml) przez 10 minut lub we wskazanych czasach (Figury 1F i 2A), i poddawano lizie (40), a rozpuszczalne frakcje analizowano. Przeciwciała były następujące: przeciw fosfo-MAPK (Thr202 / Tyr204), anty-MAPK, anty-fosfo-FRS-2 (Y196) (Cell Signaling Technology); anty-FRS-2 (H-91) i anty-FGFR-2 (C-17) (Santa Cruz Biotechnology Inc.); antyfosfotyrozyna (4G10; Upstate); królicze poliklonalne: anty-GLUT1 wobec 29 C-końcowych aminokwasów sekwencji ludzkiej, anty-GLUT4 (41) i anty-FGFR-1 przeciwko 15 C-końcowym aminokwasom sekwencji mysiej. Do immunodetekcji użyto kozie anty-mysie i anty-królicze koniugaty HRP (Bio-Rad Laboratories) i system detekcji ECL (Amersham Biosciences). Mierzyliśmy poziomy hormonów i adipokin w krążeniu myszy ob / ob traktowanych nośnikiem i FGF-21a, stosując zestawy testowe Multiplex z LINCO Research Inc. Przygotowanie tkanki, analiza histologiczna i immunobarwienie. Tkanki utrwalono przez noc w buforowanej cynkiem formalinie, a następnie przeniesiono do 70% etanolu przed obróbką przez parafinę. Pięć mikrometrowych sekcji wybarwiono H & GE. Sąsiednie 5-mikrometrowe sekcje umieszczono na dodatnio naładowanych szkiełkach. Następnie szkiełka wypiekano przez noc w 60 ° C w piecu, a następnie odparowano w ksylenie i ponownie uwodniono za pomocą stopniowanych alkoholi do wody. Odzyskiwanie antygenu przeprowadzono przez zanurzenie szkiełek w docelowym roztworze do pobierania na 20 minut w 90 ° C, schładzanie w 25 ° C przez 10 minut i przemywanie w wodzie; następnie przystąpiliśmy do barwienia immunologicznego. Wszystkie kolejne etapy barwienia przeprowadzono na Autoimmunostainer; inkubacje i wszystkie płukania przeprowadzono w 25 ° C w 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, zawierającym 0,05% Tween-20. Preparaty blokowano za pomocą roztworu blokującego białka przez 25 minut, a przeciwciało PCNA (klon PC10) inkubowano w rozcieńczeniu 1:10 przez godzinę. Następnie zastosowano biotynylowane przeciwciało i zestaw streptawidyna-HRP, a następnie znakowano 3,3 P-diaminobenzydyną (DAB). Preparaty krótko kontrastowano hematoksyliną. Wszystkie immunoreagenty i Autoimmunostainer pochodziły z Dako Corp. Badania izolacji wysepek trzustkowych i uwalniania hormonów
[podobne: choroba wysokościowa, choroba bechterewa, ciśnienie skurczowe ]