nzoz semper lublin

W testach opsonizacji liczba paciorkowców CFU na leukocyt w mieszaninie wynosiła w przybliżeniu 10. Probówki obracano koniec-koniec przez 45 minut w 37 ° C; następnie na szkiełkach wykonano rozmazy i barwiono plamą Wrighta. Opsonizację oznaczono ilościowo przez zliczenie 50 neutrofili na szkiełko i obliczenie procentu z towarzyszącymi streptokokami (procent opsonizacji). Aktywność bakteriobójczą testowych surowic odpornościowych oznaczono stosując podobny test, z tą różnicą, że do mieszaniny dodano mniej paciorkowców, którą obracano przez 3 godziny w 37 ° C. Pod koniec rotacji, 0,1-ml podwielokrotności dodawano do agaru z krwią owczą i wykonywano płytki do lejkowania żywych bakterii. Oznaczanie LD50. Porównanie zjadliwości myszy szczepu macierzystego M18 i M18. mutant został wytworzony po dootrzewnowym infekcji prowokacyjnych szwajcarskich białych myszy. Cztery grupy po 6 myszy prowokowano 10-krotnie zwiększającymi się inokulum, w zakresie od 2,7 × 104 do 2,7 × 107 CFU albo M18 albo M18 .. Zgony rejestrowano przez 7 dni po infekcjach prowokacyjnych. LD50 określono metodą Reeda i Muencha (17). Pasywne testy ochrony myszy. Osiem tygodniowi samice białych myszy szwajcarskich otrzymały 0,5 ml króliczej surowicy odpornościowej drogą dootrzewnową (2). Po 24 godzinach prowokowano je tą samą drogą ze wskazaną liczbą paciorkowców, które hodowano do wczesnej fazy logarytmicznej w bulionie Todd-Hewitt. Zgony rejestrowano dwa razy dziennie przez 7 dni. Ekstrakcja i oczyszczanie Spa z ekstraktów pepsyny z M18 .. Ekstrakcja fragmentów peptydowych z powierzchni M18. wykonano stosując rozcieńczone roztwory pepsyny w suboptymalnym pH, jak opisano wcześniej dla ekstrakcji białek pep M (18). Ekstrakt wytrącono w 60% nasyconym siarczanem amonu, intensywnie dializowano wobec wody destylowanej, a następnie liofilizowano. Mieszanina białek powierzchniowych i peptydów określana jest jako surowy peptyd M18 .. Spa zostało zidentyfikowane w surowym ekstrakcie pepsyny za pomocą testów hamowania opsonizacji. Nieoczyszczony pep M18. oddzielono przez SDS-PAGE na preparatywnym 10% żelu, stosując warunki redukujące. Cały żel został poddany elektrotranslacji do papieru nitrocelulozowego, każdy koniec został przecięty pionowo, a następnie te kawałki zabarwiono błękitem Coomassie w celu zidentyfikowania pasm białka. Środkową sekcję papieru nitrocelulozowego pocięto na poziome paski o szerokości około 8. 10 mm. Każdy pasek następnie użyto do zaabsorbowania surowicy odpornościowej królika podniesionej wobec surowego pep M18. przez 2 godziny w 37 ° C. Testy opsonizacji przeprowadzono z użyciem pochłoniętych próbek surowicy i niewchłoniętej surowicy, jak opisano powyżej. Po zidentyfikowaniu opsonowego peptydu hamującego w surowym ekstrakcie pepsyny, oczyszczono go dalej metodą preparatywnej elektroforezy żelowej (Prep Cell 491, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) sposobami opisanymi poprzednio (10). Analiza sekwencji aminokwasów Spa. Oczyszczone białko Spa zostało elektroforetycznie przeniesione na membranę z difluorku poliwinylidenu (PVDF) i poddane działaniu kompleksu białkowego i kwasu nukleinowego (Beckman Center, Stanford University Medical Center, Stanford, Kalifornia, USA) w celu sekwencjonowania końca NH2 przez degradację Edmana. Sekwencję wewnętrznego peptydu Spa określono również na Uniwersytecie Stanforda. Nienaruszone białko na PVDF trawiono proteazą LysC (0,25 umol / ml) w 37 ° C przez noc. Powstałe peptydy oczyszczono metodą HPLC na kolumnie Vydac C18. Wybrane frakcje oceniano pod względem czystości za pomocą spektroskopii masowej i wybrano peptyd o masie 1,249 kDa do sekwencjonowania końca NH2. PCR, klonowanie i sekwencjonowanie fragmentu genu spa18. Fragment genu spa został zamplifikowany przez PCR przy użyciu zdegenerowanych starterów oligonukleotydowych zawierających inozynę
[przypisy: candida albicans objawy, ciśnienie krwi normy, chłoniak rokowania ]