szpital w chodzieży ortopedia

Zastępczy wektor celowania poddano inżynierii w 3 etapach klonowania i wymagano wektora pSDKLacZ z kasetą LacZ i wektora pPNT z neomycyną (Neo) i kasetą kinazy tymidynowej z herpes simplex (tk) do wyboru pozytywnego i negatywnego. Fragment endoglinowy SmaI o długości 1426 pz, zawierający obszar promotora i kończący 8 pz powyżej ATG, zastosowano jako 5. region homologii (5. HR) i subklonowano powyżej kasety LacZ do wektora pSDKLacZ. Fragment Smal-Bglll (5100 pz intronu 1) zastosowano jako 3. HR i ligowano do miejsca stępionego XbaI (BamHI cohesive) wektora pPNT, przed kasetą tk. 5. Kasety HR i LacZ wstawiono następnie jako fragment Sall do miejsca XhoI, przed kasetą Neo w wektorze pPNT. W ten sposób geny LacZ i Neo zastąpiły region o długości 609 pz, zawierający kodon inicjacji końcowej. Konstrukt targetujący endoglin linearyzowano NotI i elektroporowano do linii komórkowej E14 pochodzącej z 129 / Ola embrionalnego trzonu (ES). Kolonie poddano selekcji pozytywnej i negatywnej za pomocą G418 i gancyklowiru (2 .M / ml) przez 10 dni. DNA wytworzono ze wszystkich opornych klonów komórek ES i trawiono ScaI. Badanie przesiewowe pod kątem prawidłowej rekombinacji przeprowadzono za pomocą analizy Southern blot przy użyciu znakowanego 32P 5. zewnętrzna sonda (fragment SmaI o 614 bp) i wewnętrzna sonda EcoRI-SacI LacZ o 1000 bp dla potwierdzenia pojedynczych zdarzeń integracji (Figura 1a). Pozytywne klony komórek ES wstrzyknięto do blastocyst C57BL / 6 uzyskując 4 płodne męskie chimery, z których 2 dały transmisję z linii płciowej. Rysunek 1Generacja końca. /. myszy. (a) Strategia kierowania. Homologiczna rekombinacja usuwa 609 pz genu End, w tym ekson (E1, 66 pz), umieszczając gen LacZ pod kontrolą jego promotora. Konstrukt targetujący zawiera fragment Smal o długości 1,4 kb (5 y HR) i fragment SmaI-Bglll o wielkości 5,1 kb (3 (3 HR) genu End flankującego kasetę LacZ-Neo. Odpowiednie zdarzenia rekombinacji zostały przebadane za pomocą analizy Southern blot z 5. zewnętrzne i wewnętrzne sondy LacZ. Bm, BamHI; Bg, Bglll; EI, EcoRI; Sa, SacI; Sc, Scal; Sm, SmaI; Xb, XbaI. (b) Identyfikacja docelowych linii komórek ES. DNA z 2 opornych na genetykę i gancyklowir komórek ES (4A-11, 4A-36) i klon typu dzikiego (WT) trawiono ScaI. Rekombinowane allele 5,4 kb WT i 7,3 kb hybrydyzujące z 5. przedstawiono sondę zewnętrzną i rekombinowany allel reagujący z sondą LacZ. (c) Genotypowanie zarodków za pomocą multipleksowej reakcji PCR. DNA z worków żółtka z miotu E9.5 pochodzącego z C57BL / 6 End + /. pokazane jest krycie; # 21 oznacza matkę, a C oznacza reakcję kontrolną PCR bez DNA. Startery ME1F i ME1R amplifikują normalny ekson (300 pz), ME2F i ME2R amplifikują normalny ekson 2 (383 pz), a ME1F i MEZR specyficznie amplifikują rekombinowany produkt (476 pz). (d) Brak mRNA endoglin w End. /. zarodki. RNA przygotowano z tych samych zarodków jak w c i analizowano pod kątem mRNA endoglinu i p-aktyny za pomocą RT-PCR. Pierwsza generacja (F1) End + /. Myszy wytwarzano przez łączenie chimer z dzikimi samicami C57BL / 6 (Taconic Farms, Germantown, New York, USA). Osiem F1 C57BL / 6 End + /. mężczyźni krzyżowali się z dzikim typem C57BL / 6 End + /. kobiety od 4 pokoleń. Te myszy F1. F4 mają mieszany genom C57BL / 6 i 129 / Ola. Fenotyp End. /. zarodki analizowano na krzyżach F1 i F2 między C57BL / 6 End + /. myszy. F1 C57BL / 6 Koniec + /. krzyżowano również z myszami CD1 typu dzikiego (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana, USA). Te myszy, z mieszaniną genów CD1, C57BL / 6 i 129 / Ola, utrzymywano przez krzyżowanie wsteczne z CD1 typu dzikiego przez 3 pokolenia. Koniec + /. myszy zostały również wytworzone na wsobnym tle 129 / Ola (ten sam szczep, co komórki ES) przez kojarzenie chimer z dzikim typem 129 / Ola (Harlan UK, Bicester, Wielka Brytania) i kolejne krzyżowanie wsteczne przez 2 pokolenia
[patrz też: choroba behceta, olx akwarystyka, chora tarczyca objawy ]